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雙模式RNA 建庫試劑盒 13332ES08
雙模式RNA 建庫試劑盒 13332ES08
  • 雙模式RNA 建庫試劑盒 13332ES08

雙模式RNA 建庫試劑盒 13332ES08

產品報價:3152元

更新時間:2020/5/27 15:12:28

地:上海

牌:翊圣生物

號:13332ES08

廠商性質: 生產型,貿易型,服務型,

公司名稱: 上海翊圣生物科技有限公司

產品關鍵詞: Hieff NGS? Dual-mode RNA Libra   RNA測序文庫   第二代高保真DNA聚合酶   DNA模板  

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翊圣生物 : (13916792673) (400-6111-883)

(聯系我時,請說明是在來寶網上看到的,謝謝?。?/b>


產品信息

QQ圖片20200225101827.png

產品描述

Hieff NGS? Dual-mode RNA Library Prep Kit for MGI?是用于MGI?測序平臺的RNA測序文庫構建試劑盒,包含RNA片段化試劑,反轉錄試劑,常規和鏈特異性dscDNA合成試劑,以及文庫擴增試劑??梢糟暯?/span>mRNA純化試劑盒或rRNA去除試劑盒構建測序文庫。二鏈合成模塊配有兩種buffer,客戶可根據需要進行常規建庫或鏈特異性建庫。其中鏈特異性二鏈合成buffer中將dTTP替換為dUTP,使cDNA第二鏈中摻入dUTP,而本試劑盒使用的高保真DNA聚合酶無法擴增含尿嘧啶的DNA模板,實現鏈特異性。本試劑盒提供的所有試劑都經過嚴格的質量控制和功能驗證,最大程度上保證了文庫構建的穩定性和重復性。

產品組分

QQ圖片20200225101856.png

運輸與保存方法

干冰運輸。-20保存,效期1。


注意事項

一、 關于操作

1. 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數次充分混勻,短暫離心后置于冰上待用。

3. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應,使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。

4. 請使用無RNase污染的耗材,并對實驗區域定期進行清理,推薦使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染。

5. PCR產物因操作不當極容易產生氣溶膠污染,進而影響實驗結果準確性。推薦將PCR反應體系配制區和PCR產物純化檢測區進行強制性的物理隔離;配備文庫構建專用移液器等設備;定時對各實驗區域進行清潔(推薦使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除噴霧),以保證實驗環境的潔凈度。

二、關于接頭連接(Adapter Ligation

1. 目前華大智造2種序號的接頭:1-128501-596。關于其使用要求,請詳見華大智造關于Adapter使用有關說明或咨詢本公司。此外,華大智造申明:2種接頭由于設計工藝不同,禁止混用,否則測序數據無法拆分!

2. 我們建議選用高質量的商業化接頭,如客戶使用自制接頭,請委托具有NGS引物合成經驗的公司,并備注需進行嚴格的防污染控制。此外,進行接頭退火操作時,請在超凈臺完成。每次只操作一種接頭,防止交叉污染。

3. 建庫過程中,接頭濃度過高或過低都會導致建庫成功率變低。本試劑盒操作方案中,所加入的接頭體積固定為5 μL,請根據初始的RNA投入量,參考表1對接頭進行稀釋。接頭稀釋液請選擇0.1×TE buffer,稀釋過的接頭可在4°C保存48小時。

1  Input Total RNA量與接頭濃度推薦表*

Input Total RNA

Adapter stock concentration

100–499 ng

2 μM

500–4000 ng

5 μM

*可根據不同類型total RNA樣本及投入量,按需求適當調整Adapter使用量

三、關于文庫擴增(Library Amplification

1. 本試劑盒中的文庫擴增組分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所組成,在第一代的基礎上,大大增強了擴增的均一性,即使是低拷貝的基因,也能進行無偏好性地擴增。

2. 文庫擴增步驟需要嚴格控制擴增循環數。循環數不足,將導致文庫產量低;循環數過多,又將導致文庫偏好性增加、重復度增加、嵌合產物增加、擴增突變積累等多種不良后果。表2列舉了使用本試劑盒進行文庫擴增,Input Total RNA量與相應擴增循環數的推薦。

2  Input Total RNA量與擴增循環數推薦表*

Input Total RNA

Number of cycles

Non-stranded

Stranded

100 ng

12-14

14-16

1000 ng

10-12

12-14

≥2000 ng

8-10

10-12

【注】:*由于不同物種和組織所提取的Total RNA中,mRNA的含量差異較大。實驗中需根據建庫起始量、物種類型及樣本處理情況適當調整擴增循環數。

四、DNA磁珠純化與分選(Bead-based Clean Up and Size Selection

1. 建庫過程中有多個步驟需要使用DNA純化磁珠,我們推薦使用Hieff NGS? DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)AMPure? XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進行DNA純化和分選。

2. 磁珠使用前應先平衡至室溫,否則會導致得率下降、分選效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

4. 轉移上清時,請勿吸取磁珠,即使微量殘留都將影響后續文庫質量。

5. 磁珠洗滌使用的80%乙醇應現用現配,否則將影響回收效率。

6. 產物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續反應;過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下,室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

7. DNA純化或長度分選產物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脫,產物于4°C可保存2天,-20°C可保存1個月。

五、關于文庫質檢(Library Quality Analysis

1. 通常情況下,構建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質量評價。

2. 文庫濃度檢測可使用:基于雙鏈DNA熒光染料的方法,如Qubit?、PicoGreen?等;基于qPCR絕對定量的方法。

3. 推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測:Qubit?等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時,無法有效區分單端連接Adapter的產物、兩端均未連接Adapter的產物及其他不完整雙鏈結構產物;qPCR絕對定量基于PCR擴增原理,僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫(即可測序的文庫),可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。

4. 文庫濃度檢測不可使用:基于光譜檢測的方法,如NanoDrop?等。

5. 文庫長度分布檢測,可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設備進行檢測。

六、自備材料(Other Material

1. mRNA富集試劑盒:Hieff NGS? mRNA Isolation Master KitYeasen Cat#12603)。 

2. rRNA去除試劑盒:Hieff NGS? MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Yeasen Cat#12253)。

3. RNA純化磁珠: Hieff NGS? RNA CleanerYeasen Cat#12602)或其他等效產品。

4. DNA純化磁珠:Hieff NGS? DNA Selection BeadsYeasen Cat#12601)或AMPure? XP BeadsA63880)或其他等效產品。

5. RNA質控:Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效產品。

6. Adapters詳情請咨詢華大智造或本公司。

7. 文庫質檢:Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效產品;文庫定量試劑。

8. 其他材料:無水乙醇、無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。

建庫流程圖

QQ圖片20200225102150.png 

使用方法

Part 1:目標RNA的富集和片段化

該步驟是建庫前的目標RNA制備,根據建庫需求可選擇Poly(A) mRNA Isolation方案(方案A)或rRNA Depletion方案(方案B)。Yeasen Cat#13332建庫模塊不包含該步驟所用試劑,請客戶根據建庫需要自備相應的試劑。

方案AmRNA純化和片段化(mRNA Purification and Fragmentation

樣本要求

該方案使用Hieff NGS? mRNA Isolation Master KitYeasen Cat#12603)進行mRNA富集。適用于起始模板量為0.1-4 μg(體積≤50 μL)的高質量動物、植物和真菌等真核生物的總RNA。如初始RNA濃度偏低,體積超過50 μL,可使用Hieff NGS? RNA CleanerYeasen Cat#12602)磁珠進行濃縮。RNA需通過Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片檢測,RIN值要求>7,以保證mRNA有完整的poly(A)尾結構。本試劑盒的mRNA分離模塊使用的是oligo (dT)磁珠,只有帶poly(A)尾的mRNA才能被提??;其他不具poly(A)尾的RNA,如非編碼RNA、無poly(A)尾的mRNA等不能適用本試劑盒。此外,FFPE樣本中的mRNA降解嚴重,通常無完整的poly(A)尾結構,故亦無法使用本試劑盒進行建庫。

操作步驟

1. mRNA Capture Beads2-8取出,靜置使其溫度平衡至室溫,約30 min。

2. 準備一個Nuclease free離心管,取0.1-4 μgRNA,用Nuclease free水將體積補至50 μL,冰上放置備用。

3. 顛倒或旋渦振蕩混勻磁珠,吸取50 μL磁珠懸液加入至50 μLRNA樣品中,用移液器吹打6次,使其充分混勻。

4. 將磁珠與RNA的混合物置于PCR儀中,65,5 min;4,hold,使得RNA變性。

5. 室溫孵育5 min,使mRNA與磁珠完全結合。

6. 將樣品置于磁力架中,室溫靜置5 min,使mRNA與總RNA分離,小心移除上清。

7. 將樣品從磁力架上取出,用200 μL Beads Wash Buffer重懸磁珠,移液器反復吹打6次以徹底混勻。將樣品置于磁力架中,室溫靜置5 min,小心移除上清。

8. 重復步驟7,共洗滌兩次。

9. 將樣品從磁力架上取出,加入50 μL Tris Buffer重懸磁珠,用移液器反復吹打6次以徹底混勻。

10. 將樣品置于PCR儀中,80,2 min;25,hold,將mRNA洗脫下來。

11. 將樣品從PCR儀中取出,加入50 μL Beads Binding Buffer,用移液器反復吹打6次以徹底混勻。

12. 室溫放置5 min,使mRNA結合到磁珠上。

13. 將樣品置于磁力架中,室溫靜置5 min,小心移除上清。

14. 將樣品從磁力架上取出,用200 μL Beads Wash Buffer重懸磁珠,移液器反復吹打6次以徹底混勻,將樣品重新放回

至磁力架中,室溫靜置5 min,吸掉全部上清。

【注】:最后需要用10 μL移液器吸干凈殘留液體。

15. 將樣品從磁力架上取出,用18.5 μL Frag/Prime buffer重懸磁珠,用移液器吹打6次以徹底混勻;將樣品置于PCR儀中(預設為94℃85℃),可參考表3選擇片段化程序,但不同物種片段化的效果有差異,客戶可先根據自己的情況,做個片段化時間的梯度,比如94℃,5 min85℃,6 min。使用Agilent 2100分析雙鏈cDNA純化產物大小。

3 mRNA片段化程序推薦

插入片段大?。?span style="font-family:Times New Roman">bp

打斷程序

150-200

94°C,6 min;

200-300QQ圖片20200225103049.png

94°C,5 min;

250-450

85°C,8 min;

400-550

85°C,6 min;

16. 片段化程序結束后,為防止poly(A)RNA與磁珠結合,請立即將樣品置于磁力架中,待溶液澄清后,轉移17 μL上清至一個新的nuclease free離心管中,立刻進入第一鏈合成反應Part 2-Step 1。

方案BrRNA去除與RNA片段化(rRNA Depletion and RNA Fragmentation

樣本要求

該方案使用Hieff NGS? MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Yeasen Cat#12253)去除Total RNA 中的rRNA。適用于人、小鼠、大鼠來源的 100 ng~1 μg 體積≤ 11 μL)總RNA 樣品;適用于完整或部分降解 RNA(如 FFPE RNA)樣品。

操作步驟

Step 1 探針雜交

1. 將探針和雜交Buffer-20 °C 取出,解凍后顛倒混勻,置于冰上備用。

2. 準備RNA樣品:根據投入量和樣品濃度,計算RNA取樣體積,用Nuclease free H2O稀釋至11 μL。

3. 按照表4200 μL PCR管中配制rRNA去除反應體系。

QQ圖片20200225102409.png


4. 使用移液器輕輕吹打混勻,瞬離將反應液離心至管底。

5. 將上述 PCR 管置于PCR(可設置梯度降溫)中,按照表5所示反應程序,進行探針雜交反應。

   

QQ圖片20200225102607.png

Step 2  RNase H消化

1.RNase H消化試劑從-20 °C取出,解凍后顛倒混勻,置于冰上備用。按照表 6 所示,配制RNase H消化反應體系。


QQ圖片20200225102751.png

2. 使用移液器輕輕吹打混勻,瞬離將反應液離心至管底。

3. 將上述 PCR 管置于PCR儀中,設置反應程序:37,30 min; 4,hold,進行RNase H消化反應。

Step 3  DNase I 消化

1. DNase I消化試劑從-20 °C 取出,解凍后顛倒混勻,置于冰上備用。按照表7所示,配制DNase I消化反應體系。


QQ圖片20200225102815.png

2. 使用移液器輕輕吹打混勻,瞬離將反應液離心至管底。

3. 將上述 PCR 管置于PCR儀中,設置反應程序:37,30min; 4,hold,進行DNase I化反應。

Step 4  RNA純化

1. 準備工作:將 Hieff NGS? RNA CleanerYeasen Cat#12602)磁珠由冰箱中取出,室溫平衡至少 30 min。用Nuclease free H2O配制 80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取 110 μL Hieff NGS? RNA Cleaner2.2×,Beads:DNA=2.2:1)至上一步產物中,移液器充分吹打混勻,室溫孵育 5 min。

4. PCR管置于磁力架中分離磁珠和液體,待溶液澄清后(約5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中,加入 200 μL Nuclease free H2O新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,室溫孵育 30 sec 后,小心移除上清。

6. 重復步驟 5,總計漂洗兩次。用 10 μL移液器吸干凈殘留液體。

7. 保持 PCR 管始終置于磁力架中,室溫下開蓋干燥磁珠(5~10 min)。

8. RNA洗脫:將PCR 管從磁力架上取下,加入18.5 μL Frag/Prime buffer,使用移液器輕輕吹打至充分混勻,室溫靜置 5 min。

9. PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置,待溶液澄清后(約3 min),小心移取 17 μL 上清至新的Nuclease free PCR 管中,進行RNA片段化。

10. RNA片段化條件需根據樣本質量進行調整,高質量的RNA樣本,片段化條件可參考mRNA片段化條件(表3)。表8推薦了FFPE不同質量樣本的片段化條件。但不同的樣本片段化效果會存在一定的差異,客戶可根據自己的樣本情況,做不同片段化條件對比,選擇合適的片段化條件。

11. 片段化結束請立即置于冰上,進入一鏈合成反應Part 2-Step 1。

 

QQ圖片20200225102842.png

Part 2RNA文庫構建

Step 1 第一鏈cDNA的合成(1st Strand Synthesis

該步驟將已經富集/片段化的目標RNA合成一鏈cDNA。目標RNA的富集可根據實驗需求和樣本情況選擇Poly(A) mRNA isolation方案或rRNA Depletion方案,詳見Part 1。

1. 將第一鏈合成試劑從-20°C取出,顛倒混勻后瞬離。按表9所示,配制第一鏈cDNA合成的反應液。


QQ圖片20200225102905.png

2. 使用移液器輕輕吹打混勻,瞬離將反應液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中,按照表10所示設置反應程序,進行第一鏈cDNA的合成。反應結束后立即進行第二鏈cDNA的合成。


QQ圖片20200225102938.png


Step 2第二鏈cDNA的合成/末端修復/A2nd Strand Synthesis/dA-Tailing):

1. 將第二鏈合成試劑從-20 °C取出,解凍后顛倒混勻;按照表11所示,配制第二鏈cDNA合成/末端修復/A反應液。


QQ圖片20200225103003.png

【注】:*如構建普通mRNA文庫,請使用含dNTPbuffer;如構建鏈特異性mRNA文庫,請使用含dUTPbuffer。

2. 使用移液器輕輕吹打混勻,瞬離將反應液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中,按照表12所示設置反應程序,進行第二鏈cDNA的合成。


QQ圖片20200225103026.png


Step 3 接頭連接(Adapter Ligation

該步驟可在末端修復和dA尾添加的產物末端,連接特定的MGI?接頭。

1. 參考注意事項二中的表1,根據Input RNA量,稀釋Adapter至合適濃度。

2. 將表13中各試劑解凍后顛倒混勻,置于冰上備用。

3. 3.3步驟結束后的PCR管中繼續配制表13所示反應體系。

QQ圖片20200225103049.png


【注】:*Ligation Enhancer使用前請上下顛倒、振蕩,充分混勻并瞬時離心后使用。

**請根據注意事項三中表1的提示,用0.1×TE buffer對接頭進行稀釋,接頭體積固定為5 μL。

4. 使用移液器輕輕吹打混勻,并短暫離心將反應液收集至管底。

5. PCR管置于PCR儀中,設置表14所示反應程序,進行接頭連接反應:

QQ圖片20200225103121.png

Step4連接產物純化和片段大小分選(Post Ligation Clean Up and Size Selection

目前有兩個方案應用于該步驟,當插入片段<200 bp時,使用方案A,通過兩次純化去除體系中的接頭殘留;當插入片段≥200 bp時,使用方案B,通過純化、分選獲得目標長度的文庫。

方案A:適用于插入片段<200 bp的文庫(需進行兩輪純化)

1. 準備工作:將Hieff NGS? DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取60 μL Hieff NGS? DNA Selection Beads0.6×,Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation產物中,渦旋或吹打混勻,室溫孵育5 min。

4. PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體,待溶液澄清后(約5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中,加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,室溫孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重復步驟5,總計漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中,開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現龜裂(不超過5 min)。

8. PCR管從磁力架中取出,加入52 μL ddH2O,渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻,室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置,待溶液澄清后(約3 min),小心移取50 μL上清至新PCR管中,再進行一輪純化。

9. 吸取40 μL Hieff NGS? DNA Selection Beads0.8×,Beads:DNA=0.8:1)至上一步產物中,渦旋或吹打混勻,室溫孵育5 min。

10. PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體,待溶液澄清后(約3 min),小心移除上清。

11. 保持PCR管始終置于磁力架中,加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,室溫孵育30 sec后,小心移除上清。

12. 重復步驟11,總計漂洗兩次。

13. 保持PCR管始終置于磁力架中,開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現龜裂(不超過5 min)。

14. PCR管從磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻,室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置,待溶液澄清后(約3 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,進行PCR擴增。

方案B:適用于插入片段大于200 bp的文庫(先純化,再分選)

方案B-1:接頭連接產物的純化

1. 準備工作:將Hieff NGS? DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取60 μL Hieff NGS? DNA Selection Beads0.6×,Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation產物中,渦旋或吹打混勻,室溫孵育5 min。

4. PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體,待溶液澄清后(約5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中,加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,室溫孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重復步驟5,總計漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中,開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現龜裂(不超過5 min)。

8. PCR管從磁力架中取出,加入102 μL ddH2O,渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻,室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置,待溶液澄清后(約5 min),小心移取100 μL上清至新PCR管中,準備進行雙輪分選。

【注】:Ligation Enhancer中含有的高濃度PEG會對磁珠雙輪分選產生影響,所以必須經過一輪純化后再進行雙輪分選。

方案B-2:雙輪分選

1. 請渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。

2. 根據DNA片段長度要求,參考表15,在上述100 μL DNA中加入第一輪分選磁珠,渦旋或移液器吹打10次混勻。

QQ圖片20200225103143.png


【注】:此表推薦的雙輪分選比例適用于AMPure? XP磁珠和Hieff NGS? DNA Selection Beads;表中“×”表示樣品DNA體積。如所需文庫插入片段主峰為200 bp時,若在接頭連接之后分選,樣品DNA體積為100 μL,則第一輪分選磁珠使用體積為0.78×100 μL=78 μL,第二輪分選磁珠使用體積為0.20×100 μL=20 μL。

3. 室溫孵育5 min。

4. PCR管短暫離心并置于磁力架中,待溶液澄清后(約5 min),小心轉移上清到干凈的離心管中,殘留1-2 μL溶液于管底。

5. 參考表15向上清中加入第二輪分選磁珠。

6. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻,室溫靜置5 min。

7. PCR管短暫離心并置于磁力架中,待溶液澄清后(約3 min),小心移除上清。

8. 保持PCR管始終處于磁力架中,加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,室溫孵育30 sec,小心移除上清。

9. 重復步驟8。

10. 保持PCR管始終處于磁力架中,開蓋干燥磁珠至剛剛出現龜裂(約3 min)。

11. PCR管從磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻,室溫靜置5 min。

12. PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后(約3 min),小心轉移20 μL上清至干凈管中。

Step 5 文庫擴增(Library Amplification

該步驟將對純化或長度分選后的接頭連接產物進行PCR擴增富集。

1. 將表16中的試劑解凍后顛倒混勻,置于冰上備用。

2. 于無菌PCR管中配制表16所示反應體系。

QQ圖片20200225103203.png

 

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻,并短暫離心將反應液收集至管底。

4. PCR管置于PCR儀中,設置表17示反應程序,進行PCR擴增。


QQ圖片20200225103225.png

*文庫擴增循環數需根據樣本質量、投入量等建庫條件進行調整,詳見注意事項三。

Step 6 擴增產物磁珠純化(Post Amplification Clean Up

1. 準備工作:將Hieff NGS? DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取45 μL Hieff NGS? DNA Selection Beads0.9×,Beads:DNA=0.9:1)至Adapter Ligation產物中,渦旋或吹打混勻,室溫孵育5 min。

4. PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體,待溶液澄清后(約5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中,加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,室溫孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重復步驟5,總計漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中,開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現龜裂(不超過5 min)。

8. PCR管從磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻,室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置,待溶液澄清后(約3 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,進行文庫定量、質檢。

Step 7 文庫質量控制

通常情況下,構建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進行質量評價,具體請參見注意事項五。

 

Step 8 文庫環化

使用Hieff NGS? Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI?Cat#13341)或其他等效產品進行文庫單鏈環化反應。

 

附錄一:mRNA片段化效果展示

                 

QQ圖片20200225103245.png


 

2. mRNA不同打斷時間對應的雙鏈cDNA片段范圍。取1 μg Universal Human Reference RNA,經mRNA提取試劑盒提取后,分別以94°C,6 min、85℃,8 min85℃,5 min處理。打斷后mRNA進行雙連cDNA的合成,經過1.8×磁珠回收后,通過Agilent 2100 Bioanalyzer進行檢測。

【注】:本結果使用的RNAAgilent公司的Universal Human Reference RNA,若使用其他來源的RNA,最好優化打斷時間。

附錄二:FFPE樣本建庫說明

1. FFPE RNA質量評價

rRNA去除建庫方案可用于FFPE等低質量的 Total RNA 樣本,但由于不同FFPE樣本的質量差距較大,需要根據樣本情況調整建庫條件。常規評價 RNA 樣本質量的參數是 RIN 值,但是對于 FFPE 這種降解的樣本,并不能完全用 RIN 值來準確衡量樣本的質量,此時還需要用到 DV200指標。DV200 表示樣本中大于 200ntRNA 片段所占的比例,對于降解嚴重的 FFPE 樣本,DV200值能夠更好的反應樣本的質量。

DV200計算方法如下:

        

QQ圖片20200225103303.png


 

在一個檢測完成的 Agilent 2100 Bioanalyzer 結果圖中,在 Local 下選擇 Advanced

勾選 Smear Analysis 下的 Perform Smear Analysis 選項

選擇Region Table頁面,鼠標右擊,選擇Add Region

調整指示線的范圍即可得到所選片段范圍 所占的比例 % of Total

 

2. FFPE RNA建庫示例

下表展示了不同質量FFPE樣本在不同建庫條件下的文庫分布,以供參考。對于降解嚴重的FFPE RNADV200<50%)和起始量低的文庫構建,我們推薦接頭連接后采用兩次純化方案,以減少文庫損失。

RNA樣本質控

建庫條件

文庫分布質控

 

RIN=2.2; DV200=74%

 

投入量:1 μg

片段化條件:85℃,7 min

接頭連接后進行兩次純化:0.6×;0.8×

鏈特異建庫擴增:14cycles

文庫產量:1283 ng


投入量:1 μg

片段化條件:85℃,7 min

接頭連接后進行純化/分選:0.6×;062×/0.15×

鏈特異建庫擴增:14cycles

文庫產量:776 ng


投入量:100 ng

片段化條件:85℃,7 min

接頭連接后進行兩次純化:0.6×;0.8×

鏈特異建庫擴增:17cycles

文庫產量:849 ng


 

RIN=2.4; DV200=40%

投入量:500 ng

片段化條件:85℃,3 min

接頭連接后進行兩次純化:0.6×;0.8×

鏈特異建庫擴增:15cycles

文庫產量:308 ng


投入量:500 ng

片段化條件:85℃,3 min

接頭連接后進行純化、分選:0.6×;0.74×/0.15×

鏈特異建庫擴增:15cycles

文庫產量:135 ng


投入量:100 ng

片段化條件:85℃,3 min

接頭連接后進行兩次純化:0.6×;0.8×

鏈特異建庫擴增:17cycles

文庫產量:68 ng


 

RIN=2.5; DV200=18%

投入量:1 μg

片段化條件:85℃,3 min

接頭連接后進行兩次純化:0.6×;0.8×

鏈特異建庫擴增:14cycles

文庫產量:264 ng


 

RIN=2.5; DV200=19%

投入量:100 ng

片段化條件:65℃,5 min

接頭連接后進行兩次純化:0.6×;0.8×

鏈特異建庫擴增:17cycles

文庫產量:22 ng



 

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建庫試劑盒

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13360ES04/16/96

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16×4/×16/×100 T

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16×4/×16/×100 T

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建庫模塊

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文庫定量

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